動物布魯氏菌病診斷技術 GB/T18646—2002

1 范圍
本標準規定了動物布魯氏菌病的診斷技術。
本標準規定的虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。
本標準規定的試管凝集試驗不適用于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜的檢疫。 2 虎紅平板凝集試驗
2.1 材料準備
2.1.1 抗原、標準陽性血清、陰性血清由制標單位提供，按說明書使用。
2.1.2 受檢血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。
2.1.3 潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm2的方格。
2.1.4 吸管或分裝器，適于滴加0.03mL。
2.1.5 牙簽或火柴桿，供攪拌用。
2.2 操作方法
2.2.1 將玻璃板上各格標記受檢血清號，然后加相應血清0.03mL。
2.2.2 在受檢血清旁滴加抗原0.03mL。
2.2.3 用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。
2.2.4 每次試驗應設陰、陽性血清對照。
2.3 判定
2.3.1 在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。
2.3.2 受檢血清在4min內出現肉眼可見凝集現象者判為陽性(+)，無凝集現象，呈均勻粉紅色者判為陰性(—)。
3 乳牛布病全乳環狀試驗
3.1 材料準備
3.1.1 布病全乳環狀抗原
由制標單位提供，按說明書使用。
3.1.2 乳樣
3.1.2.1 受檢乳樣須為新鮮的全乳。
3.1.2.2 采乳樣時應將母畜的**用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。
3.1.2.3 采集的乳樣夏季時應于當日內檢查；保存于2℃時，7d內仍可使用。
3.2 操作方法
3.2.1 取乳樣lml，加于**凝集試驗管內。
3.2.2 取充分振蕩混合均勻的全乳環狀抗原1滴(約50ul)加人乳樣中充分混勻。
3.2.3 置37℃一38℃水浴中60min。
3.2.4 加溫后取出試管勿使振蕩，立即進行判定。
3.3 判定
標準分為：
a)強陽性反應(+++)，乳柱上層乳脂形成明顯紅色的環帶，乳柱白色，臨界分明；     b)陽性反應(++)，乳脂層的環帶呈紅色，但不顯著，乳柱略帶顏色；
c)弱陽性反應(+)，乳脂層的環帶顏色較淺，但比乳柱顏色略深；
d)疑似反應(±)，乳脂層的環帶顏色不明顯，與乳柱分界不清，乳柱不褪色；     e)陰性反應(—)，乳柱上層無任何變化，乳柱顏色均勻。
4 動物布病試管凝集試驗
4.1 材料準備
4.1.1 稀釋液
0.5%石炭酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋應用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液。
4.1.2 抗原、陽性血清和陰性血清由制標單位提供，按說明書使用。
4.1.3 凝集試驗管(三分管)、試管架、吸管及溫箱。
4.2 操作方法
4.2.1 按常規方法采血分離血清。
4.2.2 運送和保存血清樣品時防止凍結和受熱，以免影響凝集價。若3d內不能送到實驗室，按每9mL血清加1ml 5%石炭酸生理鹽水(徐徐加入)防腐，也可用冷藏方法運送血清。
4.2.3 受檢血清的稀釋
以羊和豬為例，每份血清用4支凝集試管。
4.2.3.1 **管標記檢驗編碼后加1.15mL稀釋液。
4.2.3.2 第2—4管各加入0.5mL稀釋液。
4.2.3.3 然后用1ml吸管取被檢血清0.1mL；加入第1管內，并混合均勻?；旌戏椒ㄊ菍⒃撛嚬苤械幕旌弦何宋軆?，再沿試管壁吹入試管中，如此吸入、吹出3—4次，充分混勻后以該吸管吸混合液0.25ml棄去，
4.2.3.4 取0.5mL混合液加入第2管，用該吸管如前述方法混合。
4.2.3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。
4.2.3.6 稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1：12.5、1：25、1：50和1：100。
4.2.3.7 牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是**管加1.2mL稀釋液和0.05mL被檢血清。
4.2.3.8 將0.5mL20倍稀釋的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變為1：25、1：50、1：100和1：200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變為1：50、1：100、1：200和1：400。
大規模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1：25和1：50。
4.2.3.9  置37℃—40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結果。
4.2.3.10 每次試驗均應設陽性血清、陰性血清和抗原對照，即
a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。
b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清同。
c)抗原對照：1：20稀釋抗原液0.5mL，再加0.5mL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現象。
4.3 判定
4.3.1 供判定參照比濁管制備方法見附錄E(提示的附錄)。
4.3.2 結果判定
4.3.2.1 凝集反應程度分為：
參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀
a)++++菌體完全凝集，100％下沉，上層液體100％清亮；
b)+++菌體幾乎完全凝集，上層液體75％清亮；
c)十十菌體凝集顯著，液體50％清亮；
d)+凝集物有沉淀，液體25％清亮；
e)—凝集物無沉淀，液體均勻混濁。
4.3.2.2 牛、馬、鹿和駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現
“++”以上凝集現象時，受檢血清判定為陽性。
4.3.2.3 牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋，出現“++”以上凝集現象時，受檢血清判定為可疑反應。
可疑反應家畜經3周一4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經重檢仍保持可疑水平，而農場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現，該畜被判為陰性。     豬血清偶有非特異性反應，須結合流行病學調查判定，必要時應配合補體結合試驗和鑒別診斷，排除耶森氏菌交叉凝集反應。 5 動物布病補體結合試驗 5.1 材料準備
5.1.1 稀釋液：0.85％生理鹽水按常規方法配制。
5.1.2 綿羊紅細胞懸液：采取成年公綿羊血，按常規方法脫纖、洗滌、離心，用稀釋液洗滌3—4次，*后二次以2000r/min離心沉淀l0min，取下沉的紅細胞泥，以稀釋液配制成2.5％紅細胞懸液。
5.1.3  抗原、標準陽性血清、陰性血清、溶血素由制標單位提供，按說明書使用。 5.1.4        受檢血清：收集和處理見附錄A(標準的附錄)。 5.1.5        溶血素：效價測定見附錄B(標準的附錄)。
5.1.6        補體：采集及其效價測定方法見附錄C(標準的附錄)。 5.1.7        抗原：效價測定見附錄D(標準的附錄)。 5.2 操作方法
5.1.7.1            將1：10稀釋經滅能(見附錄A)的受檢血清加入2支三分管內，每管0.5mL。 5.1.7.2    其中一管加工作量抗原0.5mL，另一管加稀釋液0.5mL。 5.1.7.3            上述2管均加工作量補體，每管0.5mL，振蕩混勻。
5.1.7.4            置37℃一38℃水浴20min，取出放于室溫(22℃一25℃)。
5.1.7.5            每管各加2單位的溶血素0.5mL和2.5％紅細胞懸液0.5mL。充分振蕩混勻。 5.1.7.6            再置37℃一38℃水浴20min，之后取出立即進行**次判定。
5.1.7.7            每次試驗需設陽性血清、陰性血清、抗原、溶血素和補體對照。主試驗各要素添加量和順序如表1。
表1 布魯氏菌病補體結合試驗的主試驗                                       mL

 
5.3判定
5.1.7.8            **次判定，要求不加抗原的陽性血清對照管，不加或加抗原的陰性血清對照
管，抗原對照管呈完全溶血反應。
5.1.7.9            初判后靜置12h作**次判定，**次判定時要求溶血素對照管，補體對照管呈完全抑制溶血。
5.1.7.10        對照正確無誤即可對受檢血清進行判定，受檢血清加抗原管的判定參照標準比色管記錄結果。標準比色管的制備方法見附錄F(提示的附錄)。 5.1.7.11        判定標準：
0—40%溶血判為陽性反應；     50%一90%溶血判為可疑反應；     100%溶血判為陰性反應。
牛、羊和豬補體結合反應判定標準均相同。

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