PCR實驗室
Pcr實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其**度高達納米級別，**檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人*適合使用哪類抗病毒**、判斷**療效如何、給臨床**提供了可靠的檢驗依據。
一、開展pcr實驗室應具備的條件：
1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室；
實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗室設置要求；
熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。
3、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓并取得合格證書；
4、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證；
PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，并持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生**，確保實驗室長期穩定運行。
5、必須在無菌無塵環境下進行操作。
二、pcr實驗室的功能：
能夠對患者病情進行科學、準確、實時的掌控，并結合抗HBV與T細胞**來打破**耐受，阻斷肝病病毒復制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復制模板難以**，人體**耐受狀態不易打破等醫學難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉換速度，殺滅血液及肝細胞內的病毒，為防止再感染提供了長期保護，有效阻斷和逆轉肝纖維化、肝硬化進程。
三、怎樣建立pcr實驗室
1、建立樣品準備區
這個區域專門用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：
（1）PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。
（2） 用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
（3） DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠**。
（4） 組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。
（5）大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。
（6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。
（7）任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。
2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、建立前PCR區。
該去專門用于準備各種反應，這個區域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。
4、PCR實驗室試劑的操作。
（1）所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。
（2）所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓**。
（3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
（4）所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
（5） 新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。
（6） 所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性**的瓶子和管子。
（7） 樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
5、在前PCR區建立PCR混合物。
（1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。
（2）如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠**的PCR成分。
（3）作為一個規則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
（4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。
（5）當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用*少數量的核酸。
（6）由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。
6、控制污染的方法。
已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。
7、后PCR區PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動
四、 PCR實驗室平面布局
PCR擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉污染，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產物分析區。
各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。
五、實驗室空調通風系統設計及壓力控制
PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。
1、試劑貯存和準備區
該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。
對與氣流壓力的控制，本區并沒有嚴格的要求。
2、標本制備區
該區域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。
本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。
3、擴增反應混合物配制和擴增區
該區域主要進行的操作為DNA擴增。此外，已制備的DNA模板 (來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。
本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。
4、擴增產物分析區
該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。
本區是*主要的擴增產物污染來源，因此對本區的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。
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